对于种鸡来说，必须在饲料中添加充足的维生素D3，以便使蛋黄中能够沉积足够水平的钙三醇，从而满足胚胎钙代谢的额外需要。维生素D3的最低添加率旨在满足鸡的需要量从而避免雏鸡和成年母鸡发生钙化不良，最高添加率旨在满足快速生长肉鸡品系的需要，以及满足对“弱腿症”遗传性敏感的肉鸡品系的需要。因此，饲料中维生素D3的含量必需严格控制。

九九科技参考国标（GB/T 17818-2010），利用全新高性能的，经实践检测可提供饲料中维生素D3的HPLC检测方案，得出的结果准确可靠，检出限好，适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素D3的测定，仅供广大用户参考。

以下是维生素D3的液相(HPLC)测定的详细检测方法。

1　 仪器与试剂

1.1 仪器
　　LC-10Tvp高效液相色谱仪；
　　Vertex 色谱柱：150mm×4.6mm×5μm ；
　　分析天平，感量为分别为0.001g，0.0001g，0.00001g；
　　圆底烧瓶，带回流冷凝器；
　　恒温水浴锅；
　　旋转蒸发器；
　　超纯水器。

1.2 试剂
　　无水乙醚：不含过氧化物；
　　无水乙醇；
　　正己烷，色谱纯；
　　1,4二氧六环；
　　甲醇，色谱纯；
　　2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）；
　　无水硫酸钠；
　　氮气（纯度99%）；
　　碘化钾溶液；
　　淀粉指示液；
　　硫代硫酸钠溶液；
　　氢氧化钾溶液；
　　L-抗坏血酸纯品；
　　酚酞指示剂；
　　氯化钠；
　　维生素D3乙酸酯标准品：含量≥99%。

2　 检测原理
　　用碱溶液皂化试样，乙醚提取维生素D3，蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇并将部分溶液注入高效液相色谱反相净化柱，收集含维生素D3淋洗液，蒸发至干，溶解于适当溶剂中，注入高效液相色谱分析柱，在264nm处测定，外标法定量。

3　 试样溶液的制备

3.1 皂化
　　称取试样适量，置入圆底烧瓶中，加L-坏血酸乙醇溶液，使试样完全分散、浸湿，加氢氧化钾溶液，混匀，置于沸水浴上回流，不时震荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用无水乙醇、水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40℃。

3.2 提取
　　定量转移全部皂化液于盛有无水乙醚的分液漏斗中，用蒸馏水分2次~3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖、放气，随后混合，激烈震荡，静置分层。转移水相于第二个分液漏斗中，分次用乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用氯化钠溶液洗涤一次，再用蒸馏水多次洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠脱水，转移到棕色容量瓶中，加BHT使之溶解，用乙醚定容至刻度。以上操作均在避光通风柜内进行。

3.3 浓缩
　　从乙醚提取液中分取一定体积置于旋转蒸发器烧瓶中，在水浴温度约50℃，部分真空条件下蒸发至干或用氮气吹干。残渣用甲醇溶解并稀释，离心或通过0.45μm过滤膜过滤，收集清液移入小试管，用于高效液相色谱仪分析。以上操作均在避光通风柜内进行。

3.4 高效液相色谱净化柱净化
　　用甲醇溶解圆底烧瓶中的残渣，向高效液相色谱净化柱注射甲醇溶液收集含维生素D3馏分于小容量瓶中，蒸发至干，溶解于正己烷中。
　　以下为高效液相色谱净化条件：
　　色谱净化柱：Lichrosorb RP-8，250mm×10mm×10μm；
　　流动相：甲醇+水=90+10；
　　流速：2.0mL/min；
　　温度：室温；
　　检测波长：264nm。

4　 色谱条件
　　色谱柱：Vertex 色谱柱　150mm×4.6mm×5μm；
　　流动相：甲醇+水=95+5；
　　流速：1.0mL/min；
　　温度：室温；
　　进样量：20μL。
　　检测波长：264nm。

5　 维生素D3标准高效液相色谱图